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實驗新人必讀(五):細胞培養那些事兒


作者:解螺旋.子非魚

導語

細胞培養的路上,有多虐心就有多少需要值得注意的地方。小小的平皿之中,細胞點點,引無數英雄競掛東南枝。正所謂“萬事開頭難”,即便是細胞復蘇與保存這兩件看似簡單的事情,也能造成實驗汪內心無比巨大的陰影面積。好在小魚這里有本細胞培養秘籍,可讓細胞這個熊孩子徹底變為你的貼心小棉襖。

其實,剛剛復蘇的細胞就像是剛剛出生的baby,非常脆弱,需要各位小伙伴的細心呵護,不然,細胞就會被我們花樣玩死。為了避免細胞不明不白的掛掉,我們就要對細胞的各種習性了如指掌。

 

1. 俗語道,到什么山上唱什么歌,不同細胞用不同的培養液。此時,就不得不提起培養基里的“四大金剛”—MEM、DMEM、1640、F-12,它們基本參與了90%以上種類細胞的培養過程。

 

MEM作為帶頭大哥,能力非常**,號稱是應用*廣泛的細胞培養液。


DMEM作為隨時緊跟老大MEM的二弟,青出于藍而勝于藍,濃度要高出2~4倍,可分為高糖型(含葡萄糖4500mg/L)和低糖型(含葡萄糖1000mg/L)。


老三1640中規中矩,營養成分比較簡單,比DMEM少一點糖和谷光甘肽,常用于**細胞的培養。


小兄弟F12常用來支持CHO、Hela和L-細胞生長以及原代大鼠肝細胞和前列腺上皮細胞的培養。MEM和F12 這兩種培養基各取1/2,即可形成神經生物學*通用的培養基。

 

在此,奉送一個不同細胞系對應的不同培養液的圖,供大家參考。

2. 細胞生長的空間密度是細胞培養的關鍵。具體養細胞時應該摸索細胞喜歡的生長空間密度,既不能讓細胞瓶里的細胞因擁擠不堪而萎靡不振;也不能讓細胞濃度低于1~5×10^5個/mL而導致“孤獨死”(因為細胞的健康生長需要細胞間的連接)。因而細胞接種前,要先通過細胞計數來調整細胞濃度。

 

3. 當培養的貼壁細胞形態不好時,可在傳代時,先倒掉舊的培養基,加入3ml新的培養基(有無血清都可以)洗滌一次,用滴管吸走,再加入3ml培養基,沿著瓶底輕輕吹打一遍,然后吸走。這時在正式進行消化、吹打。

 

其次,把吹打下的細胞懸液加入到含有新培養基的培養瓶內,置于培養箱里培養,按時間點觀察細胞貼壁情況(10min,20min,30min)。而后迅速倒出其中的培養基,加入3ml新培養基再輕輕洗一次,然后加入完全培養基培養并觀察細胞生長情況以及形態。直至找到細胞上乘的形態為止。

 

4. 至于在培養瓶中加入多少培養基量,則是需要實驗汪們自己去摸索的。對于生長快的細胞,易生長的細胞加少一點培養基,細胞形態會更好,但是要注意對換液時間的把握。

 

5. 如何選擇培養瓶。一般,生長速度慢的細胞如果想要更漂亮的細胞狀態,那么采用塑料瓶會比玻璃瓶的效果好;生長速度快的細胞,用玻璃瓶培養的效果會更好。因此,對于同一種細胞,在其生長速度慢的時候(比如細胞剛復蘇時或者原代培養),塑料瓶會好一點;而在其生長旺盛的時候,玻璃瓶則相對會好一點。

6. 細胞凍存時,蓋子要擰緊,不然復蘇水浴時會滲水,造成細胞污染。因而凍存管要選擇原配的管子和蓋子(不同牌子、型號的管子會有差別),蓋子擰緊后*好用封口膜封住。且每支凍存管都要標上細胞的名稱、凍存時間,并記錄在冊,以免后續復蘇細胞時,取錯細胞。

 

7. 細胞凍存時要嚴格進行梯度降溫(-4℃→-20℃~-40℃→-80℃→液氮)。要知道冰火兩重天的生活環境只會讓嬌弱的細胞自爆身亡,謹記:緩降溫!但如果真心趕時間時,可以使用細胞凍存盒進行細胞凍存,而后盡快將其轉入液氮中。此外,要定期測量液氮罐里的液氮儲備,以保證細胞全部浸在液面下。

 

8. 細胞解凍時,由于凍存管管壁較厚、隔熱,而導致水浴時間太長(2min還沒融化)時,可以將水浴鍋的溫度調至40℃左右,可以縮短解凍時間。

 

9. 提前預定超凈臺,減少復蘇后插在冰盒里等待的時間,可避免細胞房人滿為患,超凈臺使用緊張,復蘇1h后,還沒有加入新的培養液。(高濃度DMSO防止胞內形成冰晶,凍存時保護細胞,但復蘇融解后,浸泡時間太久會對細胞有毒性)

 

10. 復蘇細胞時一定要有耐心,因為有些細胞在復蘇一星期后才會真正有起色。因而,盡管細胞在復蘇三四天后沒有任何動靜,也不要輕易倒掉所有細胞,要耐心等待,兩周后再做決定。

11. 有關DMSO的一些注意事項:


?(1) DMSO能夠快速穿透細胞膜進入細胞中,降低冰點、延緩凍存過程,同時提高細胞內的離子濃度、減少細胞內冰晶的形成,從而減少細胞損傷程度。

 

?(2) DMSO在溶解過程中會放熱,應先與培養基混勻后再加血清,同時凍存液*好提前配置,DMSO現配對細胞的毒性可能更大;

 

?(3) 復蘇時,要離心去除DMSO,并用新鮮的培養基洗滌1-2次,注意離心的時候速度不要太快。








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