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細胞支原體污染的熒光檢測方法


DNA螢光染色法

· 原理︰利用螢光染劑(bisbenzimide, Hoechst 33258)偵測支原體污染。此染劑會結合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區域,因為支原體之DNA中A-T含量占多數(55~80%),所以可將其染色而偵測。被支原體污染之細胞經染色后,在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點,即為支原體之DNA,證明有支原體之污染。 

· 特點︰簡單、經濟與靈敏,廣泛使用,可作為例行之偵測步驟。可以偵測不易培養之支原體,例如M. hyorhinis,較直接培養法快,約一星期即可知道結果。 
· 缺點:有時仍會有螢光背景,影響判讀。 


步驟: 
· 取出培養之Vero細胞,吸除培養液。于每個well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液,靜置10 min后,吸除固定液,用PBS洗滌三次。 
· 于每個well中,加入1 ml Hoechst 33258 working solution,室溫下靜置5-10 min。 
· 吸掉Hoechst 33258染液后,以無菌水洗滌3次,風干后加入1滴的封片劑,并以蓋玻片覆蓋之。 
· 以100x-400x螢光顯微鏡觀察。觀察細胞核外是否有藍色螢光小點或是絲狀點之螢光物產生。 
結果判讀︰
若有支原體污染,在Vero細胞核外與細胞表面會出現藍色螢光小點或是絲狀點。其形狀一致,與細胞殘片染成之不規則點狀物不同。其螢光可維持數星期。
圖例 (A)為negative result : 螢光顯微鏡下,只觀察到Vero細胞的細胞核,測試樣品沒有支原體的污染。(為positive result : 在Vero細胞核外與細胞表面會出現藍色螢光小點和絲狀點,表示測試樣品有支原體的污染。 

(A)Negative result 
螢光顯微鏡下,只觀察到Vero細胞的細胞核,測試樣品沒有支原體的污染。 

(Positive Result 在Vero細胞核外與細胞表面會出現藍色螢光小點和絲狀點,表示測試樣品有支原體的污染。



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